Ще декідька кінетичних параметрів характеристики ферментів
Кофекменти і кофактори
Роль АТФ у роботі ферментів
Генна регуляція
Теорія оперона
Зворотній зв’язок
ВСТУП
Одна з характерних властивостей усіх живих організмів полягає в їх здатності до обміну речовин (метаболізму) і до здійснення великої кількості різноманітних хімічних реакцій.
Основу наших сучасних уявлень щодо обміну речовин було закладено ще в 1780 р., коли Лавуазьє та Лаплас всупереч поширеній в ті часи помилковій теорії ‘флогістона’ прийшли до висновку, що дихання є особливою формою горіння. Цього висновку вони дійшли за допомогою простих дослідів, в яких порівнювалось споживання киснюі утворення вуглекислого газу твариною (для досліду було взято щурів) та свічкою, що горіла, вміщеними у скляні сосуди.
Уявлення про те, що обмін речовин у всіх живих організмів здійснюється за допомогою ферментів, або ензимів - специфічних органічних каталізаторів, що синтезуються живими клітинами, - формувалось поступово, починаючи з 1815 р., коли Кірхгоф отримав з пшениці екстракт, здатний перетворювати крохмаль на цукор.
Довготривала суперечка між Лібіхом і Пастером про те, чи можна вважати живими самі ферменти, знайшла розв’язку на користь Лібіха в 1897 р., коли Едуард Бухнер приготував з дріжжів безклітинний екстракт, що перетворював цукор на спирт. В результаті інтенсивних ензимологічних досліджень вдалося виділити велику кількість ферментів, довести, що всі вони являють собою макромолекули білкової природи і що кожен фермент регулює певну хімічну реакцію завдяки специфічній конфігурації своєї молекули. Речовина, з якою відбувається хімічна реакція (субстрат), з’єднується з ферментом, утворюючи з ним специфічний комплекс (далі : ФСК - ферметно-субстрактний комплекс). Таким чином, ферменти регулюють швидкість і специфічність практично всіх хімічних реакцій, що протікають в живих організмах.
Робота ферментів відбувається впорядковано, серіями етапів, що називаються метаболічними шляхами. Тому хімічні процеси в живих організмах проходять з дивовижною ефективністю. Поперше, непотрібних продуктів реакцій накопичується дуже мало, оскільки кожен продукт однієї реакції виступає в ролі субстрата для наступної і т.д. Друга перевага послідовного ходу реакцій стає зрозумілою, якщо врахувати, що хімічні реакції можуть протікати в будь-якому напрямку, тобто вони є оберненими. Якщо кожен продукт окремої реакції в процесі утворення одразу вступає в іншу реакцію, то тенденція до оберненості зводиться до мінімуму. Більше того : якщо можливий кінцевий метаболіт також буде використовуватись швидко, то ціла серія реакцій буде рухатись до завершення. Інша перевага полягає в тому, що групи ферментів, що беруть участь в загальних метаболічних шляхах, можуть об’єднуватись. Деякі було виявлено в невеличких везикулах (мембранних пухирцях) в цитоплазмі. Інші зв’язані з мембранами спеціалізованих органел, таких, як мітохондрії або хлоропласти.
ПОНЯТТЯ ПРО ЕНЕРГЕТИЧНУ ЦІННІСТЬ
Хоча ферменти прискорюють енергетично вигідні реакції, вони ніяк не можуть індукувати енергетично не вигідні реакції. Використовуючи аналогію з водою можна сказати, що самі по собі ферменти не здатні примусити воду текти вгору. Але для того, щоб клітина мала змогу рости і ділитися, в ній повинні відбуватись саме такі процеси : клітини повинні будувати великі й складні молекули з малих і простих. Ми вже побачили, що це відбувається, головним чином, завдяки ферментам, під дією яких енергетично вигідні реакції, що використовують сонячну енергію і продукують тепло, зчіплюються з енергетично не вигідними реакціями, які збільшують ступінь біологічної невпорядкованості. Розглянемо більш детально, як досягається таке зв’язування.
Перш за все потрібно уважніше поставитися до виразу ‘енергетична цінність’, котрим ми до цього часу користувались занадто вільно. Як вже згадувалось вище, спонтанно можуть відбуватися лише ті реакції, в результаті яких невпорядкованість у Всесвіті зростає.
Невпорядкованість збільшується у тому випадку, коли енергія виділяється у вигляді тепла ; критерієм збільшення невпорядкованості може виступати величина, що наз. вільною енергією G. Ця величина визначається у такий спосіб, що зміна, яку позначають ^ G, визначає міру невпорядкованості, що виникає у Всесвіті в результаті реакції. За визначенням, ‘енергетично вигідними’ є ті реакції, під час протікання яких вивільняється велика кількість вільної енергії ; інакше кажучи, такі реакції відрізняються великою за модулем від’ємною величиною ^ G і створюють більший ступінь невпорядкованості. Такі реакції мають яскраво виражену тенденцію до спонтанного протікання, хоча швидкість цих реакцій залежатиме і від інших чинників, як то - присутність специфічних ферментів. І навпаки, реакції, в яких ^ G має додатнє значення (наприклад, реакція утворення пептидного зв’язку між двома амінокислотами), підвищують впорядкованість Всесвіту і не можуть протікати спонтанно, самовільно. Так : енергетично не вигідні реакції відбуваються лише в тому випадку, коли вони зв’язані з іншими реакціями, що мають настільки від’ємну величину ^ G, що й ^ G всього процесу стає від’ємним.
Хід більшості реакцій може бути кількісно передбаченим. Відомо багато термодинамічних параметрів, виходячи з яких можна розрахувати зміну вільної енергії ^ G для більшості важливих метаболічних реакцій клітини. Загальна зміна вільної енергії при функціонуванні того чи іншого метаболічного шляху буде при цьому виражена сумою змін енергії на кожному з етапів цього шляху : ^ Gзаг=сума ^ G
Розглянемо дві реакції : А - Б та В - Г, значення ^ G яких відповідно дорівнюють +2 та -17 ккал / моль (нагадаємо, що 1 моль
23 речовини містить 6*10 молекул). В тому випадку, коли ці реакції зв’язані одна з одною, ^ G всього процесу буде дорівнювати -15 ккал / моль. З цього випливає, що енергетично не вигідна реакція А - Б, яка не може протікати спонтанно, може бути обумовлена енергетично вигідною реакцією В - Г за умови, що існує механізм, що забезпечує зв’язування цих двох реакцій.
Одна з найважливіших функцій білків полягає в специфічному каталізі хімічних реакцій. Лігандом - молекулою, що взаємодіє з білком - в цьому випадку виступає молекула субстрата, зв’язування якої ферментом є необхідною передумовою хімічної реакції. Ферменти здатні дуже сильно прискорювати хімічні реакції - значно сильніше за будь-які штучні каталізатори. Настільки високу ефективність можна пояснити кількома факторами : по-перше, ферменти збільшують локальну концентрацію молекул субстрата в каталітичному центрі і утримують відповідні атоми в орієнтації, що необхідна для наступної реакції. Але найважливіше значення має той факт, що частина енергії зв’язування безпосередньо використовується для каталізу. Справа в тому, що молекули субстрата, перш ніж перетворитися на продукти реакції, проходять через ряд проміжних форм із зміненою геометрією і зміненим електронним розподілом. Вільна енергія всіх цих проміжних форм і особливо найменш стабільних перехідних станів значно знижена, якщо молекула зв’язана з поверхнею фермента. Звичайно ферменти мають значно більшу адаптованість до нестабільних перехідних станів субстратів, ніж до їх постійних форм. Використовуючи енергію зв’язування, ферменти допомагають субстратам прийняти певний перехідний стан і таким чином прискорюють певну реакцію.
ЩЕ ДЕКІЛЬКА КІНЕТИЧНИХ ПАРАМЕТРІВ
ХАРАКТЕРИСТИКИ ФЕРМЕНТІВ
Деякі ферменти ковалентно взаємодіють з одним із своїх субстратів. При цьому субстрат зв’язується з амінокислотою або молекулою кофермента (небілковий органічний кофактор). Такі ферментативні реакції часто відбуваються в декілька стадій так, що один субстрат захоплюється центром зв’язування і ковалентно зв’язується, а потім реагує на поверхні фермента з другим субстратом.
З наближенням до кінця кожного реакційного циклу вільний фермент відновлюється. Спосіб дії ферментів накладає обмеження на кількість молекул субстрата, яка може бути ‘оброблена’ однією молекулою фермента за одиницю часу. При збільшенні концентрації субстрата швидкість утворення продукта спочатку також збільшується до максимальної величини. В цій точці досягається насичення молекул фермента субстратом, і тепер швидкість реакції, яку позначають Vmax, залежить тільки від того, наскільки швидко може фермент обробити одну молекулу субстрата. Відношення цієї швидкості до концентрації фермента наз. числом оборотів, яке для багатьох ферментів складає близько 1 000 молекул субстрата за 1с, але у виняткових випадках може досягати значення 1 000 000 і більше.
За низької концентрації субстрата швидкість реакції зростає пропорціонально концентрації субстрата. Однак по мірі збільшення концентрації - ^ V зменшується, і пропорціональність порушується, тут іде реакція змішаного порядку. При подальшому збільшенні концентрації субстата, швидкість реакції стає постійною і не залежить від концентрації субстрата, віббувається насичення субстратом. При цьому лімітуючим фактором стає концентрація фермента.
За допомогою цього графіка ми можемо визначити й інший кінетичний параметр характеристики ферментів - константу Міхаеліса, яку позначають Км. (Варто зазначити, що Км не має змінюватись в залежності від структури субстрата, від рівня PH та температури.)
1913 року Міхаеліс і Ментем опублікували теорію загального
К1 К2 механізму ферментативних реакцій : E + S - ES - E + P
К-1 Вони ввели поняття Vmax і отримали, що крива насиченості (тобто залежність швидкості реакції від концентрації субстрата) є рівнобічною гіперболою. Вони довели, що максимальна швидкість є однією з асимптот кривої, а відрізок, що відсікається на осі абсцис в області максимальної швидкості - другою асимптотою, тобто константа в рівнянні швидкості дорівнює за абсолютним значенням концентрації субстрата, що необхідна для досягнення половини Vmax.
Для більшості ферментів концентрація субстрата, за якої швидкість реакції складає половину максимальної, Км відображає міцність зв’язування субстрата з ферментом. Великі значення Км відповідають слабкому зв’язуванню, і навпаки.
Цікавою особливістю клітинного метаболізму є той факт, що кожна клітина регулює синтез продуктів, що є необхідними для її нормального існування, виробляючи їх в потрібній кількості. В той же час клітина уникає перевиробництва, яке призвело б до марних витрат енергії та матеріалів. Доступність вихідних молекул субстрата або коферментів - основний лімітуючий фактор, і з цієї причини більшість ферментів працює із швидкістю, далекою від максимальної.
Температура також впливає на швидкість ферментативних реакцій. Підвищення температури збільшує їх швидкість, але до певної межі.
Як видно з малюнка, швидкість більшості ферментативних реакцій подвоюється при підвищенні температури на кожні 10 градусів, але після 40 градусів спадає дуже швидко. Збільшення швидкості реакцій відбувається за рахунок підвищення енергії реагуючих компонентів ; зменшення швидкості пов’язано з тим, що в самій молекулі фермента починається вібрація, яка руйнує водневі зв’язки і порушує інші, відносно слабкі взаємодії, що утримують молекулу у певному стані.
На активність фермента впливає і рівень PH навколишнього середовища. Конформація фермента залежить від притягання і відштовхування між негативно (кислотними) і позитивно (основними) зарядженими групами амінокислот. При зміні PH ці заряди змінюються, що призводить до зміни структурної організації фермента - інколи настільки - що він не може функціонувати. Мабуть, найвагомішу роль відіграє зміна зарядів активного центру та субстрата, що відбивається на здатності утворювати зв’язки. Інколи деякі ферменти можуть працювати за рівня PH, далекого від максимального. Припускають, що це протиріччя є не ‘помилкою’ процеса еволюції, а способом регуляції активності ферментів.
КОФЕРМЕНТИ і КОФАКТОРИ
Живі системи мають механізми включення та інгібування активності фермента. Деякі ферменти утворюються в неактивній формі, а потім за необхідності вони активуються - переважно іншими речовинами, їх та інші небілкові фактори регуляції ферментативної активності наз. кофакторами.
Одним з прикладів кофакторів є іони, які виступають у цій ролі для деяких специфічних ферментів. Наприклад, іон магнію необхідний для більшості ферментативних реакцій, під час яких здійснюється переніс
2+ фосфатних груп між молекулами. Два позитивних заряди Mg утримують в певному положенні негативно заряджені фосфатні
+ + групи. Інші іони (наприклад, K ,Na , тощо) виступають в аналогічній ролі в інших ферментативних реакціях. В деяких випадках іони можуть сприяти об’єднанню ферментативних білків.
Інколи дуже важливу роль у ферментативних реакціях відіграють коферменти. Ще на межі XIX - XX ст. було встановлено, що для нормального живлення, крім солей, білків, жирів та вуглеводів, потрібні ще особливі речовини, які Ф.Гопкінс назвав додатковими харчовими факторами, а Функ у 1911 р. - вітамінами. Це відкриття було стимулом для вивчення ролі цих речовин в процесі метаболізму, для дослідження питання про те, чому вони є необхідними для одних організмів і зовсім не потрібні іншим. Лише зараз твердо встановлено, що ці речовини необхідні всім живим організмам (значення вітамінів для організмів вперше встановив російський лікар М.Лунін у 1880 р.). Багато організмів, однак, здатні синтезувати всі вітаміни, які їм необхідні, а ті організми, що не мають пристосування до синтезу вітамінів, повинні отримувати їх із їжею.
Специфічна роль вітамінів в процесі обміну тепер є загальновідомою. В усіх вивчених випадках виявилось, що вони стають частиною більш крупної молекули, яка функціонує в якості кофермента і є абсолютно необхідною для протікання певних реакцій. Захворювання, що викликані нестачею вітамінів, - це наслідки порушень метаболізму, зв’язаних з нестачею того чи іншого ферменту. Отже, тепер ми впритул підійшли до коферментів і розглянемо деякі з механізмів їх роботи.
Наприклад, в деяких окислювально-відновних процесах електрони
_ передаються молекулі, яка виступає акцептором e . У будь-якій клітині можна виявити декілька різних акцепторів електронів, кожен з яких специфічно пристосований для утримання електрона на певному енергетичному рівні. Прикладом може слугувати NAD -нікотинамідаденіндинуклеотид.
На перший погляд NAD здається складним і, однак він складається з добре нам відомих компонентів біологічних молекул. Два п’ятивуглецевих цукрів (рибози) з’єднані двома фосфатними групами. Один цукор зв’язаний з аденіном, а другий - з іншою азотистою основою- нікотинамідом. Нікотинамідне кільце - активний кінець NAD - приєднує _ e-ни. Нікотинамід - це вітамін, що називається ніацином. Як вже зазначалось вище, вітаміни є сполуками, які необхідні в невеликих кількостях живим організмам ; люди і тварини не можуть синтезувати вітаміни і тому мусять отримувати їх із їжею. Клітини людини можуть синтезувати NAD, якщо в їжі міститься нікотинамід. Багато вітамінів є коферментами або частиною коферментів.
Нікотинамідаденіндинуклеотид, подібно до багатьох коферментів, піддається циклічним перетворенням. Так NAD+
+ _ регенерує, коли NADH+H передає свої e - ни іншому акцептору. Таким чином, наявне число молекул NAD відносно невелике, хоча він бере участь в багатьох внутрішньоклітинних ферментативних реакціях.
Деякі ферменти використовують кофактори, котрі знаходяться в комплексі з білком. До них відносяться так звані простетичні групи, наприклад, залізо-сірковмісна група фередоксинів (білок, який бере участь у процесі фотосинтезу у рослин шляхом відновлення NADP до NADPH2), піридоксальфосфат (вітамін B2) або трансаміназ.
Також коферменти беруть участь у переносі специфічних хімічних груп. Оскільки кінцевий фосфатний зв’язок АТФ (регулювання, зв’язане з гідролізом АТФ, детально розглядається далі) легко розривається з виділенням вільної енегрії, це з’єднання є ефективним джерелом фосфата для великої кількості різних реакцій фосфорелювання. Багато різноманітних, хімічно лабільних зв’язків поводиться подібним чином. Наприклад, специфічні молекули - переносчики містять ацетильні або метильні групи, з’єднані реактивними зв’язками, що дозволяє цим групам легко переходити на інші молекули. Одна й та сама молекула - переносчик нерідко бере участь у багатьох різних реакціях біосинтезу, для проходження яких необхідна наявність їх специфічних реакційноздатних груп.
Прикладом такого кофермента - переносчика може слугувати ацетилкофермент А (ацетил - СоА), що утворюється під час розщеплення глюкози. Він переносить ацетильну групу, приєднану до нього лабільним тіоефірним зв’язком.
Ця ацетильна група легко переходить на іншу молекулу, таку, наприклад, як молекула жирної кислоти. Інший приклад, що заслуговує на увагу - це біотин, який переносить в багатьох реакціях біосинтезу
_ карбоксильну групу (-- СОО ).
В наведеній послідовності реакцій біотин ковалентно зв’язаний з ферментом піруват-карбоксилазою. Активована карбоксильна група, що
_ утворюється з бікарбонат-іона (HCO3 ), зв’язується з біотином в реакції, що протікає за рахунок енергії, виділеної під час гідролізу АТФ. Потім карбоксильна група переноситься до метильної групи групи пірувату з утворенням оксалоацетата.
Нижче наведені деякі коферменти, що беруть участь в реакціях переносу хімічних груп.
Кофермент Група, що переноситься
АТФ фосфатна
NADH, NADPH _ водень + е (гідрид-іон)
CoA ацетильна
Біотин карбоксильна
S - Аденозилметионін метильна
Деякі коферменти можуть бути настільки міцно зв’язаними з білковою молекулою фермента, що фактично є її частиною. Як приклад можна навести гени, що містять в собі залізо, в молекулі гемоглобіна або цитохромів ; тіамінпірофосфат у ферментів, що беруть участь в переносі карбоксильної групи. В процесі еволюції кожен кофермент був відібраний за певною ознакою хімічної активності, яку він проявляє в комплексі з білком. Досить часто коферментами є дуже складні органічні молекули, хімічні якості яких в комплексі з білком не завжди зрозумілі в деталях. Крім реакційно здатного центру до складу коферментів нерідко входять залишки, що зв’язують їх з відповідними білками.
РОЛЬ АТФ У РОБОТІ ФЕРМЕНТІВ
Жива клітина є далека від рівноваги хімічна система ; адже наближення живої системи до рівноваги означає її розпад і смерть. Продукт кожного фермента звичайно швидко витрачається, оскільки використовується в якості субстрата іншим ферментом даного метаболічного шляху. Ще більш важливо, що велика кількість ферментативних реакцій зв’язана з розщепленням АТФ на АДФ та неорганічний фосфат. Щоб це було можливим, пул АТФ в свою чергу повинен підтримуватись на рівні, далекому від рівноваги, так щоб відношення концентрації АТФ до концентрації продуктів його гідролізу було високим. Таким чином, пул АТФ відіграє роль ‘акумулятора’, що підтримує постійний переніс в клітині енергії та атомів по метаболічним шляхам, що визначаються присутніми ферментами.
Отже, розглянемо процес гідролізу АТФ і його вплив на роботу ферментів. Уявімо собі типовий біосинтетичний процес, при якому два мономери - А та Б - повинні об’єднатись між собою в реакції дегідратації (її також називають конденсацією), що супроводжується виділенням води :
А - Н + Б - ОН — АБ + Н2О
Зворотня реакція, яку називають гідролізом, в якій молекула води руйнує ковалентно зв’язану сполуку А - Б, майже завжди буде енергетично вигідною. Це має місце, наприклад, при гідролітичному розщепленні білків, нуклеїнових кислот і полісахаридів на субодиниці.
Загальна стратегія, за якою відбувається утворення клітини А - Б із А - Н та Б - ОН, включає в себе багатоступінчасту послідовність реакцій, в результаті яких відбувається зв’язування енергетично невигідного синтезу потрібних сполук із збалансованою вигідною реакцією.
Гдролізу АТФ відповідає велика негативна величина ^ G, тому гідроліз АТФ часто відіграє роль енергетично сприятливої реакції,завдяки якій здійснюються внутрішньоклітинні реакції біосинтезу.
На шляху від А - Н та Б - ОН до А - Б, пов’язаному з гідролізом АТФ, енергія гідролізу спочатку переводить Б - ОН в високоенергетичну проміжну сполуку, яка потім безпосередньо реагує з А - Н, утворюючи А - Б. Найпростіший механізм даного процесу включає в себе переніс фосфата від АТФ до Б - ОН з утворенням Б - ОРО3, або Б - О - Р, причому в цьому випадку сумарна реакція відбувається лише у дві стадії:
1) Б - ОН + АТФ — Б - О - Р + АДФ
2) А - Н + Б - О - Р — А - Б + Р
Оскільки проміжна сполука Б - О - Р, що утворюється в процесі реакції, потім знову руйнується, сумарні реакції можна описати за допомогою наступних рівнянь :
А- Н + Б - ОН — А - Б та АТФ — АДФ + Р
Перша, енергетично невигідна реакція, виявляється можливою тому, що вона зв’язана з другою, енергетично вигідною реакцією (гідроліз АТФ). Прикладом зв’язаних біосинтетичних реакцій подібного типу може бути синтез амінокислоти глутаміна.
Величина ^ G гідролізу АТФ до АДФ і неорганічного фосфата залежить від концентрації всіх реагуючих речовин і за звичайних для клітини умов лежить в межах від -11 до -13 ккал / моль. Реакція гідролізу АТФ, зрештою, може бути використана для здійснення термодинамічно невигідної реакції із значенням ^ G, рівним приблизно +10 ккал / моль, звичайно, за присутності відповідної послідовності реакцій. Однак для багатьох реакцій біосинтезу виявляється недостатнім навіть ^ G = -13 ккал / моль. В цих та інших випадках шлях гідролізу АТФ змінюється таким чином, що спочатку утворюються АМФ і РРі (пірофосфат). На наступній стадії пірофосфат також піддається гідролізу ; загальна зміна вільної енергії всього процесу становить приблизно -26 ккал / моль.
Яким чином енергія гідролізу пірофосфату використовується в біосинтетичних реакціях ? Один з шляхів можна продемонструвати на прикладі наведеного вище синтезу сполуки А - Б із А - Н та Б - ОН. При допомозі відповідного ферменту Б - ОН може вступити в реакцію з АТФ і перетворитися на високоенергетичну сполуку Б - О - Р - Р. Тепер реакція складається з трьох стадій :
1) Б - ОН + АТФ — Б - О - Р - Р + АМФ
2) А - Н + Б - О - Р - Р — А - Б + РРі
3) Ррі + Н2О — 2Рі Сумарну реакцію можна представити у наступному вигляді :
А - Н + Б - ОН — А - Б і АТФ + Н2О — АМФ + 2Рі Оскільки фермент завжди прискорює каталізовану ним реакцію як в прямому, так і в зворотньому напрямку, сполука А - Б може розпадатися, реагуючи з пірофосфатом (реакція, обернена до стадії 2). Однак енергетично вигідна реакція гідролізу пірофосфату (стадія 3) сприяє підтриманню стабільності сполуки А- Б за рахунок того, що концентрація пірофосфату залишається дуже низькою (це запобігає протіканню реакції, оберненої до стадії 2). Таким чином, енергія гідролізу пірофосфату забезпечує протікання реакції в прямому напрямку. Прикладом важливої біосинтетичної реакції такого типу є синтез полінуклеотида.
ГЕННА РЕГУЛЯЦІЯ
Одним з найбільш розповсюджених методів регуляції активності ферментів є регуляція розмірів їх виробництва, зокрема, генна регуляція.
Класичною генетикою встановлено, що всі соматичні клітини організму несуть один і той же набір генів, тобто містять однакове число хромосом, що несуть одні й ті самі алелі. І не зважаючи на це, клітини багатоклітинного організму дуже різноманітні за будовою та функціями. Навіть у однієї й тієї ж самої клітини швидкість синтезу білкових молекул може вар’ювати в залежності від обставин і потреб. Дані про механізми, що регулюють активність генів у клітині, було вперше отримано при вивченні регуляції синтезу ферментів у кишкової палички (Escherichia coli).
У 1961 р. Франсуа Жакоб і Жак Моно провели ряд експериментів, бажаючи зрозуміти природу індукції синтезу ферментів у E.coli. Вважають, що в клітинах E.coli синтезується близько 800 ферментів. Синтез деяких з них відбувається безперервно і їх називають конститувними ферментами ; інші утворюються тільки в присутності певного індуктора, який може й не бути субстратом даного фермента. Такі ферменти, прикладом яких є - галактозадаза, наз. індуцибельними ферментами.
E.coli швидко росте в культуральному середовищі, що містить глюкозу. При перенесенні клітин в ті ж самі умови, але із лактозою замість глюкози, ріст починається не одразу,а після короткої затримки, але потім іде з такою ж швидкістю, як і за наявності глюкози. Проведені дослідження показали, що для росту в лактозному середовищі необхідна наявність двох речовин, які E.coli звичайно не синтезує : - галактозидазу, що гідролізує лактозу до глюкози та галактози, і лактозопермеазу, що робить клітину здатною швидко вбирати лактозу з середовища. Це може бути прикладом того, як зміна в умовах середовища - заміна глюкози лактозою - індукує синтез певного фермента. Інші експерименти з E.coli показали, що високий вміст в середовищі амінокислоти триптофана перешкоджає виробництву триптофансинтетази - фермента, що є необхідним для синтезу триптофана клітиною. Синтез - галактозидази є прикладом індукції, а перешкодження синтезу триптофансинтетази - прикладом репресії фермента. На основі цих спостережень Жакоб і Моно запропонували механізм, що пояснює індукцію і репресію - механізм ‘вмикання і вимикання’ генів (за це відкриття вони отримали Нобелевську премію у 1965 р.).
ТЕОРІЯ ОПЕРОНА
Генетичні інструкції, що визначають амінокислотну послідовність згадуваних вище білків, містяться в структурних генах, причому інструкції для - галактозидази і лактозопермеази тісно зчеплені в одній хромосомі. Активність цих генів регулюється ще одним геном, який називають геном - регулятором і який перешкоджає переходу структурних генів до активного стану. Ген - регулятор може знаходитись на деякій відстані від структурних генів. Докази його існування було отримано при вивченні мутованих клітин E.coli, що були позбавлені цього гена і тому виробляли - галактозидазу безперервно. Ген - регулятор містить генетичну інформацію для синтезу репресора, котрий перешкоджає активності структурних генів. Репресор діє на структурні гени не прямо, а опосередковано, здійснюючи вплив на регіон, що прилягає до структурних генів і називається оператором. Оператор і структурні гени, якими він управляє в сукупності наз. опероном.
Репресор є особливим алостеричним білком, який або зв’язується з оператором, придушуючи його активність (‘вимикає’ його), або не зв’язується з ним, дозволяючи проявляти активність (залишає ‘ввімкненим’). Коли оператор ввімкнено, на структурних генах відбувається транскрипція і утворення мРНК, яку рибосоми і тРНК транслюють в поліпептиди ; а коли оператор вимкнено, мРНК не утворюється, а отже, кодовані нею поліпептиди не синтезуються.
Механізм, від якого залежить, чи приєднається алостеричний білок до оператора, простий і в той же час чутливий до змін внутрішніх умов в клітині. В молекулі репресора є якнайменше два активних регіони ; до одного з них може приєднуватись молекула індуктора, а інший існує для приєднання до оператора, що вимикає весь оперон.
У еукаріотів не було виявлено оперонів. Кожна цитоплазматична мРНК несе інформацію про синтез лише одного білка. Однак у рослин зустрічаються системи регуляції. Мутації, що проявляються в необмеженому утворенні груп ферментів, було виявлено у кукурудзи (Zeamays) та ослинника (Oenothera).
ЗВОРОТНІЙ ЗВ’ЯЗОК
Окрім генетичних механізм, котрі змінюють функції клітин, контролюючи синтез окремих ферментів, відомий ряд фізіологічних контролюючих систем, що здійснюють пряму інгібіцію шляхом зворотнього зв’язку. Це сприяє досягненню досить сталої концентрації різних малих молекул в клітині. Регуляторні молекули такого типу корегують потік метаболітів певним метаболічним шляхом завдяки тимчасовому збільшенню або зменшенню активності ключових ферментів. Наприклад, перший фермент у тій чи іншій послідовності реакцій звичайно інгібується кінцевим продуктом цього метаболічного шляху за принципом негативного зворотнього зв’язку ; таким чином, якщо накопичується забагато кінцевого продукту, подальше надходження попередників до даного метаболічного шляху автоматично інгібується.
У випадку розгалудження або перетину метаболічних шляхів, що відбувається досить часто, є, як правило, декілька точок, в яких здійснюється контроль різними кінцевими продуктами. Наскільки важливі такі процеси регуляції за принципом зворотнього зв’язку, видно з малюнка.
На цьому малюнку зображена регуляція ферментативної активності в послідовностях реакцій, що ведуть до утворення амінокислот.
Регуляція за принципом зворотнього зв’язку може спрацьовувати майже миттєво і є оборотною ; крім того, певний кінцевий продукт може інгібувати ферменти, що каталізують його синтез, і при цьому бути активатором ферментів іншого метаболічного шляху.
Отже, ми описали декілька механізмів регуляції ферментативної активності в клітині, а також кілька важливих факторів, які супроводжують цей процес у прокаріотичних і еукаріотичних клітин.
